Diagnòstic Bioquímic i Molecular de Malalties Hereditàries

Biòpsia líquida: estudi d'ADN tumoral lliure circulant

L'Hospital Clínic és centre pioner en la incorporació d'eines moleculars no invasives per al seguiment de pacients amb càncer de pulmó. L'estudi a ADN tumoral lliure circulant de mutacions específiques al gen del receptor del factor de creixement epidèrmic (EGFR) en mostra de plasma, permet estratificar el pacient i monitoritzar la resposta al tractament en pacients amb càncer de pulmó de cèl·lules no petites. Aquesta tècnica beneficia aquells pacients on no és possible obtenir una biòpsia o en pacients amb múltiples metàstasis on biopsiar cadascuna seria impracticable.

Espectrometria de masses en tàndem

La cromatografia líquida acoblada a l'espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS) és una potent tècnica analítica que ha revolucionat el laboratori clínic aquests darrers anys. Presenta grans avantatges permetent analitzar amb molt poca quantitat de mostra un ampli espectre de metabòlits en un temps curt,  que alhora es poden identificar i quantificar amb una gran  selectivitat, sensibilitat i especificitat.   

L'aplicació d'aquesta tecnologia ens ha permès ampliar el cribratge neonatal de Catalunya, de 3 a 20 malalties, així com quantificar diversos biomarcadors per al diagnòstic i la monitorització de tractament de més de 400 entitats genètiques. Amb aquesta metodologia també hem pogut substituir tècniques radiomètriques obtenint la mateixa sensibilitat i una millor especificitat, així com eliminar tècniques obsoletes que requerien una gran quantitat de volum de mostra.   

Seqüenciació massiva de l'exoma complet

La seqüenciació massiva de l'exoma complet permet obtenir les variants de totes les regions gèniques que codifiquen per a proteïnes. Tot i que l'exoma representa menys del 2% de tot el genoma (~45Mb), s'estima que conté el 85% de les variants causants de malalties mendelianes. És una tecnologia de seqüenciació d'alt rendiment.

Al nostre hospital utilitzem el protocol de seqüenciació massiva Nextera flex for Enrichment amb sondes Exoma complet (Illumina) i posterior seqüenciació a la plataforma NextSeq550 (Illumina). Disposem d'un servei d'anàlisi bioinformàtica de les dades. Posteriorment, un facultatiu realitza l'anàlisi genètica. En base a la informació clínica facilitada es filtra per panells de gens definits (per exemple Hipertensió pulmonar, cardiomiopaties familiars o malalties metabòliques) o es crea un panell virtual específic (per exemple pacients amb discapacitat intel·lectual que presenten dismorfia o altres fenotips associats, o pacients amb malalties molt rares amb una prevalença (l/1.000.000). Finalment, s'emet un informe amb els resultats trobats, la seva interpretació i l'assessorament genètic.

Les dades generades s'emmagatzemen i s'ofereix l'oportunitat de fer ampliació d'estudi en els casos que ho requereixin (per exemple: nous gens identificats associats a la malaltia o aparició d'altres fenotips amb origen genètic ). Un cop detectada la causa genètica, es pot procedir a l'estudi dels familiars a risc i proporcionar un adequat assessorament genètic. 

    
Seqüenciació massiva per panells de gens 

(Trusight Cancer; Hiperlipidèmies, MODYS, etc)

El fonament de la seqüenciació massiva de panells de gens és el mateix que en el cas de l'exoma. L'ús de seqüenciació massiva de panells de gens permet reduir costos en comparació amb la seqüenciació de l'exoma complet. Aquest estudi permet (segons el disseny) incorporar altres regions d'interès més enllà dels exons i regions intròniques flanquejants, presenta cobertures majors de les regions analitzades, però ofereix un nombre reduït de gens a analitzar, que pot variar depenent de la mida i el disseny de cada panell. 

En l'actualitat oferim l'estudi del panell de càncer, el panell d'hiperlipidèmies o el panell MODYS entre d'altres. En tots els casos, un facultatiu realitza l'anàlisi genètica i emet un informe amb els resultats trobats, la seva interpretació i l'assessorament genètic.

Seqüenciació Sanger

Es tracta d'un mètode de seqüenciació que consisteix a amplificar un fragment d'interès mitjançant PCR i posteriorment fer una nova reacció en què s'incorporen selectivament nucleòtids terminadors marcats amb fluorescència barrejats amb nucleòtids normals. Això dóna lloc a fragments de diferents mides que acaben amb un nucleòtid marcat amb fluorescència. El producte d'aquesta reacció se sotmet a una electroforesi capil·lar amb lectura simultània de fluorescència, on els fragments s'ordenen per mida i s'obté un electroferograma de fluorescència que es transforma en una seqüència de nucleòtids mitjançant un programari danàlisi específic. Aquest procés permet l'anàlisi d'un fragment petit d'ADN (300-1000b) i detecció de variants puntuals i petites insercions/delecions amb alta fiabilitat.

MLPA

Es tracta d'una variant de la PCR, on s'amplifiquen múltiples seqüències diana a les quals s'afegeixen encebadors específics (sondes) que s'uneixen de forma específica a la seqüència d'interès i tenen una mida diferent coneguda marcades amb fluorescència. Aquests fragments de diferents mides s'amplifiquen i posteriorment se sotmeten a una electroforesi capil·lar amb lectura simultània de fluorescència. En aquest cas s'obté un perfil que mostra becs de mida diferent amb diferent àrea sota la corba. Comparant mostres de pacients a estudi amb mostres control podem identificar: duplicacions (major àrea sota la corba en pacients que en controls), delecions (menor àrea sota la corba en pacients que en controls) o identificar presència/absència de variants concretes. En una reacció de MLPA podem analitzar fins a ~50 fragments diferents per reacció incloent anàlisi de guanys o pèrdues de material genètic i/o anàlisi de variants específiques.

Hibridació genòmica comparativa o CGH

La hibridació genòmica comparativa o CGH (per les sigles en anglès Comparative Genomic Hybridization) és un mètode de citogenètica molecular emprat per analitzar variacions del nombre de còpies (copy number variants o CNV). Relaciona el nivell de ploïdia de l'ADN d'una mostra en comparació d'una mostra de referència sense la necessitat de fer un cultiu cel·lular. L'objectiu d'aquesta tècnica és comparar de manera ràpida i eficient dues mostres d'ADN genòmic per detectar guanys o pèrdues de material genètic.

L'aCGH emprat al nostre laboratori es compon de més de 60.000 sondes de tipus oligonucleòtid. Aquest disseny permet interrogar més de 300 regions del genoma causants de reordenaments recurrents relacionats amb síndromes genòmiques conegudes amb una alta cobertura (de mitjana 1 sonda/10Kb), oferint un temps de resposta en mostres prenatals de < strong>10-15 dies laborables des de la recepció de la mostra.

Estudi d'expansió de triplets (TP-PCR)

La TP-PCR és una modificació de la PCR, específica per a l'estudi de zones repetides. S'hi utilitza un encebador adjacent a la zona repetida i un altre encebador dissenyat sobre la repetició que té afegida una cua que no hibrida amb l'ADN motlle. Aquesta cua és complementària a un tercer encebador anomenat universal. Els productes obtinguts mitjançant la TP-PCR s'analitzen mitjançant electroforesi capil·lar.

En cas que existeixi expansió, s'obté una imatge electroforètica típica d'escala, on cada bec correspon a una de les repeticions de l'expansió. Aquesta tècnica permet detectar grans ampliacions fins i tot quan no es poden amplificar per PCR convencional, cosa que millora el diagnòstic d'aquest tipus de malalties.

Realització d'estudis funcionals per a la caracterització de variants de significat incert (VUS) en malalties metabòliques hereditàries

Hem desenvolupat diferents estudis funcionals en fibroblasts (obtinguts de biòpsia de pell o altres teixits) per demostrar el bloqueig d'una determinada via metabòlica, concretament per al diagnòstic de defectes del metabolisme del piruvat, de malalties mitocondrials i de deficiències de la beta -oxidació mitocondrial. A més, ens permet confirmar l'efecte de mutacions de significat incert trobades per a aquestes entitats.