Servei de Microbiologia

Sistema Kiestra

El sistema Kiestra és una cadena automatitzada per processar mostres microbiològiques que ens permet, de manera relativament senzilla, donar sortida a les més de 30.000 mostres d'urinocultiu i frotis que es processen anualment.

Consta de 4 mòduls:

• El sistema d'emmagatzematge de medis de cultiu BD Kiestra™ SorterA™
• El sistema d'identificació BD Kiestra™BarcodA™, on les mostres s'identifiquen amb els medis de cultiu corresponent segons la procedència clínica.
• El processador de mostres BD Kiestra™ InoqulA™ automatitza el processament de mostres tant líquides com no líquides. Es basa en una tecnologia de comptes rodants, que permet generar més colònies aïllades que el ratllat basat en bucles (el que es realitza en una sembra manual) eliminant la necessitat de subcultiu, cosa que pot escurçar la identificació de patògens i les proves de sensibilitat als antimicrobians.
• L'incubador i capturador d'imatges BD Kiestra™ ReadA™ Compact on els medis de cultiu ja sembrats s'incuben. En aquest mòdul també es fan les captures d'imatge dels medis per poder fer la lectura i interpretació del cultiu a l'estació de treball.

Aquest innovador sistema de processament de mostres microbiològiques ha permès aconseguir millorar la productivitat i la capacitat del personal millorant el flux de treball del laboratori, així com la qualitat dels resultats reduint lerror humà i proporcionant resultats precisos i més ràpidament. Això s'ha aconseguit optimitzant el creixement bacterià amb temps de creixement i condicions d'incubació estandarditzats en un entorn automatitzat controlat.

Sistema MALDI-ToF

El desenvolupament de la tecnologia MALDI-ToF MS (matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry), en espanyol: desorció/ionització làser assistida per una matriu amb detecció de masses per temps de vol, ha permès la utilització de l'espectrometria de masses en la identificació de microorganismes mitjançant l'anàlisi de proteïnes, principalment ribosomals, mitjançant la creació d'un espectre de masses que és específic per a cada gènere i espècie bacteriana.

Un espectròmetre de masses es compon de tres unitats funcionals, una font ionitzant per transferir ions a les molècules de la mostra en una fase gasosa, un analitzador de masses que separa els ions d'acord amb la relació massa/càrrega i un dispositiu de detecció per monitoritzar els ions separats.

Una petita porció d'una colònia de bacteris crescuda al mig de cultiu sòlid es diposita directament sobre una placa metàl·lica conductora. Posteriorment, a la placa amb el microorganisme s'hi afegeix una solució saturada d'un compost orgànic de baixa massa, anomenada matriu.

Després de l'assecatge, la mostra del microorganisme i la matriu es cristal·litzen i formen un dipòsit sòlid de mostra incrustat a la matriu, la qual és essencial per a la ionització. S'introdueix a l'espectròmetre de masses, on la barreja és irradiada amb polsos curts d'un raig làser. La interacció entre els fotons de les molècules de làser i de la matriu, causats per l'absorció de l'energia de l'anvers, desencadena una sublimació de la matriu en una fase gasosa, seguida per la ionització de la mostra del microorganisme amb mínima fragmentació.< /p>

En ionitzar-se, les proteïnes són accelerades a través d'un camp electrostàtic i després són expulsades en un tub de vol al buit on se separen en funció de la velocitat o temps de vol, arribant finalment al detector de masses que genera informació característica de la composició del microorganisme mitjançant un espectre de pics, davant de la seva relació massa/càrrega (m/z), anomenada també empremta digital de la massa dels pèptids (peptide mass fingerprinting).

Un cop generat, el perfil espectral del microorganisme de prova és comparat automàticament mitjançant un programa informàtic amb una base de dades d'espectres que és construïda a partir de ceps de referència, permetent la identificació del microorganisme, a nivell d'espècie.< /p>

Sistema Flow

S'utilitza una plataforma semi-automatitzada de PCR multiplex en temps real (sistema FLOW de Roche). El sistema permet la implementació de diversos panells per a la detecció de múltiples patògens gastrointestinals i respiratoris. L'aliquotat de la mostra, l'extracció d'àcids nucleics, la preparació de les PCR i la detecció en temps real es duen a terme en plataformes automatitzades que són controlades per un programari específic. El sistema permet la implementació ràpida de tests per a la detecció de patògens emergents, com ha estat el cas del SARS-CoV-2, depenent de les necessitats del laboratori.

La traçabilitat de la mostra, l'intercanvi d'arxius entre els diferents equips del sistema i la verificació dels resultats obtinguts són controlats per un programari que està connectat al sistema informàtic de laboratori (LIS).

Seqüenciació massiva

Les tècniques de seqüenciació massiva de nova generació o next generation sequencing (NGS) ens permeten seqüenciar múltiples fragments de material genètic de forma paral·lela, produint milions de seqüències alhora.

Un experiment de seqüenciació massiva consta de quatre etapes principals: extracció de l'ADN de la mostra o aïllat, preparació de les llibreries, seqüenciació pròpiament dita i anàlisi bioinformàtica i interpretació dels resultats.

A Microbiologia, l'ús de tècniques de NGS ha suposat una revolució i té nombroses aplicacions.

Al nostre laboratori, utilitzem la seqüenciació massiva en tres grans camps. D'una banda, per a l'estudi de la microbiota: determinació de la composició (quins microorganismes tenim a la nostra mostra) i la quantitat relativa de les comunitats microbianes (en quina proporció es troba cadascun d'aquests microorganismes). Aquest tipus d'anàlisi es pot fer de dues maneres: amplificar un gen comú a tots els microorganismes presents a la mostra (targeted sequencing) o bé amplificar tots els gens presents a la mostra (shotgun sequencing).

En el primer cas, es fa servir el gen que codifica la subunitat 16S de l'ARN ribosomal (16S rARN) per a bacteris. La segona opció, en la qual seqüenciem tots els gens presents a la mostra, proporciona una quantitat d'informació molt més gran que en el cas anterior i cada vegada s'està fent servir amb més freqüència.

D'altra banda, les tècniques de NGS les estem utilitzant per seqüenciar ceps bacterians, cosa que ens permet obtenir el genoma complet i, així, identificar gens de resistència i virulència, comparació de ceps, entre altres aspectes. És molt útil en la identificació dels mecanismes de resistència a antibiòtics i en estudis d'epidemiologia molecular i dinàmica de transmissió. D'altra banda, des de ja fa uns quants anys, s'empra la NGS per a la detecció de mutacions de resistència a antiretrovirals en pacients VIH.
 

IR Biotyper

L'espectrofotometria d'infrarojos per transformada de Fourier a l'anàlisi epidemiològica que realitza l'IRBiotyper permet caracteritzar la relació clonal d'aïllats bacterians en base a l'anàlisi de les vibracions dels carbohidrats que es troben a les glicoproteïnes i la càpsula externa de la majoria de bacteris.

L'IRBiotyper obté un espectre d'absorció de carbohidrats de superfícies en un rang de longitud d'ona (1.300-800 cm-1) que és característic per a cada aïllat i, de manera semblant a l'anàlisi per PFGE, els espectres es comparen mitjançant anàlisi informàtica per obtenir una matriu de distància que s'utilitza per determinar el grau de relació fenotípica entre els aïllats. Aquells aïllats que presentin un valor de distància per sota del valor de tall designat es consideren relacionats i s'inclouen al mateix clúster.

Presenta avantatges addicionals a tècniques tan àmpliament utilitzades com el PFGE i el MLST, ja que permet l'anàlisi d'un nombre molt superior de mostres en un temps molt més curt, fet que el converteix en un mètode idoni per a la realització d'estudis epidemiològics. en temps real i la detecció precoç de brots nosocomials per clons d'alt risc.